Resistensbestämning

Resistensbestämning av bakterier är en central del av det dagliga arbetet vid det kliniskt bakteriologiska laboratoriet. Varje laboratorium i Sverige utför mellan 500 och 2000 bestämningar per dag. Resistensbestämning utföres på relevanta kliniska isolat (ur prover framodlade bakterier med sanno-lik klinisk relevans). För att ge den behandlande läkaren flera valmöjligheter undersöks varje isolat med avseende på flera antimikrobiella medel. Resistensbestämningen görs för att detektera de bakterier som akvirerat resistensmekanismer. Resultatet av resistensbestämningen skall samtidigt försöka prognosticera den kliniska utgången av en behandling med det aktuella medlet. Resultaten av individuella bestämningar kan sammanställas årsvis (sjukhusvis, regionvis, etc) och utgöra grund för en epidemiologisk övervakning av resistensutveckling inom den region (län motsv) som laboratoriet ansvarar för. Rapporter till centrala instanser kan ge en rikstäckande statistik med tidiga signaler om oönskade trender med rekommendationer om åtgärder.

Lappdiffusion

I princip samma analys kan göras med en enklare metod - den sk lappdiffusionen. Antibiotikum i standardiserad mängd sättes till papperslappar (kommersiellt tillgängliga). Den aktuella bakterien sprids på en agarplatta (så att slutresultatet blir en nästintill konfluerande växt, se bilden ovan) varefter antibiotikalappar (4 - 6 olika antibiotika på en platta) läggs på agarytan och plattan inkuberas i 18 - 20 timmar. Antibiotikum diffunderar från lappen ut i agarn och bildar i agarn en koncentrationsgradient (högst koncentration under lappen, logaritmiskt fallande koncentrationer mot periferin). Runt lappen bildas en hämningszon utan bakterieväxt vars storlek är beroende på bakteriens känslighet för respektive medel. Hämningszonens storlek anges som zondiametern. Hämningszonens kant motsvarar en koncentration i agarn och denna koncentration motsvarar bakteriens MIC-värde (mg/l) för medlet. Koncentrationen i agarn är svår att bestämma eller att räkna ut. Det vanligaste sättet att skaffa sig en uppfattning om vad denna koncentration motsvarar är att för ett antal bakterier göra en regressionsanalys mellan MIC-värden bestämda i spädningsmetoden och zondiametrar bestämda med lappdiffusion. Om logMIC avsätts mot zondiameter erhålles en regressionslinje ur vilken en zondiameterns approximativa motsvarighet i koncentration kan utläsas. Regressionsanalysen bör göras artspecifik då det föreligger variationer mellan olika arter i tillväxthastighet, påverkan av sura metaboliter mm som kan förflytta respektive ändra lutningen på regressionslinjen.

Med någon av de angivna metoderna kan således fastställas den approximativa koncentration som behövs för att hämma bakteriens tillväxt (celldelning).

Som framgår av de länkade graferna kan man med populationsstudier inom en art ganska lätt avgöra vilka bakterier som tillhör vild-typen och vilka som akvirerat resistensmekanismer.

I figuren visas schematiskt ett antal artspecifika regressionslinjer samt deras "gemensamma" regressionslinje. Som framgår motsvaras ett visst MIC-värde av olika hämningszoner för olika species. Om man bestämmer att ett visst MIC-värde ska utgöra skiljelinje mellan känsliga och icke-känsliga bakterier måste detta representeras av olika zongränser för olika arter. 

En kommitté (Referensgruppen för Antibiotikafrågor, RAF) bestående av bakteriologer, infektionsläkare, barnläkare, öronläkare, allmänläkare och klinisk farmakolog bestämmer för varje antibiotikum vilket MIC-värde som skall utgöra skiljelinjen mellan känsliga och icke-känsliga bakterier (MIC-gränser) och vilka zondiametrar som i lappdiffusions-testet i dagligt laboratoriearbete skall motsvara dessa MIC-gränser. Besluten fattas med utgångspunkt från varje antibiotikums dokumenterade kliniska effekt vid olika doseringar, dess farmakologi, toxicitet och på basis av hur MIC- och zondiameterpopulationer fördelar sig för olika species. Man tar särskilt stor hänsyn till resistensmekanismer och man försöker att med sina gränser (för såväl MIC som zondiametrar) undvika att klyva biologiskt homogena populationer. Kommittén publicerar sina rekommendationer på RAF´s hemsida på web-adressen: http://www.srga.org.

I histogrammet över Streptococcus pneumoniae visas zondiametrar för många isolat av S.pneumoniae (pneumokocker) i Sverige och i Indien. Populationen mellan 20 och 35 mm representerar nativa ("wild-type") bakterier som saknar resistensmekanism mot penicilliner. Den avgränsas tydligt mot populationerna till vänster (6 - 19 mm) som motsvarar ca 3 % av totalantalet och som representerar S.pneumoniae med PBP-förändringar i cellväggen som gör att penicilliner och cefalosporiner inte binder till de penicillinbindande enzymerna i cellväggssyntesen på ett normalt sätt. Som framgår är skillnade mellan Sverige och Indien inte stor avseende penicillinresistens hos pneumokocker. 
I detta histogram visas en motsvarande analys av drygt 1000 Staphylococcus aureus och fucidinsyra 1991 (staplar uppåt) jämfört med 1996 (staplar nedåt). Det är återigen uppenbart hur den nativa populationen till höger lätt avgränsas med en zondiametergräns. Den helt resistenta delen av stafylokockerna längst till vänster (ca 7 %) är också lätt avgränsade. Det lämnar en andel mellan de två tydliga populationerna som är svårare att klassificera och som för S.aureus och fusidinsyra är ovanligt stor. I de fall man anser att det kliniska resultatet av behandling med medlet i förhållande till bakteriens känslighet är tveksamt klassas bakterien som resistent, dvs man fäller hellre än friar.   
I analysen över KNS (=koagulasnegativa stafylokocker (CNS i bilden), som är en heterogen grupp innehållande flera olika stafylokockspecies där S. epidermidis dominerar) har man ställt zondiametrar runt en lapp innehållande oxacillin (ett isoxazolylpenicillin) i relation till förekomst (röd) respektive avsaknad av MEC-genen (blå). Denna gen kodar för resistens mot meticillin hos både S.aureus och KNS. Den har påvisats med en oligonukleotidprob. Som synes förmår isoxazolylpenicillinlappen tydligt skilja (vid 12 mm) isolat med respektive utan MEC-gen från varandra. De som har genen klassificeras som resistenta mot isoxazolylpenicilliner (MRSE) och andra betalaktamantibiotika. Gula KNS är konsekutiva kliniska isolat och gröna staplar utgör konsekutiva isolat av S.aureus.   
Histogrammet visar nödvändigheten av att varje bakterieart analyseras för sig. Varje art har sin egen tydligt markerade fördelning och zongränser måste fastställas art-vis.
Ingen av de använda metoderna för rutinmässig resistensbestämning har en reproducerbarhet som tillåter att den homogena nativa populationen delas upp i olika känslighetsgrupper. 
 

Ett analyssvar med resistensbestämningen kan se ut som i följande exempel:

Synergitest

 
Med synergism avses att den sammanlagda effekten av två antimikrobiella medel är större än den effekt som motiveras av respektive medel (enkelt uttryckt: 1+1=3). Kända synergistiska kombinationer är trimetoprim + sulfonamid, gentamicin + bensylpenicillin (alt ampicillin) gentemot enterokocker (under förutsättning att man först uteslutit höggradig aminoglykosidresistens), ampicillin + mecillinam gentemot Enterobacteriaceae. Det klassiska synergitestet, schackbordstitrering, är jobbigt att utföra. Metod och tolkning av schacktitrering för synergitest ligger utanför omfattningen av kursen.